近年来，在生物医疗领域，细胞和基因治疗（Cell&Gene Therapy, CGT）取得了显著进展。以抗CD19和BCMA为代表的多种CAR-T免疫细胞疗法在治疗血液肿瘤方面取得突破，同时，基于AAV载体的基因疗法为罕见疾病提供了新的治疗选择。此外，CRISPR基因编辑技术的发展使基因治疗进入了新纪元，体外基因编辑疗法CTX001即将上市，而体内基因编辑疗法也显示出良好的临床数据。然而，CRISPR技术的安全性问题引发关注，特别是因其直接作用于基因组DNA，任何不准确的改变均可能带来长期风险。因此，FDA等监管机构提出了基因治疗安全性的指导原则，主要包括对基因组完整性的评估和脱靶编辑活动的识别。

本篇文章将详细介绍各类脱靶检测技术。脱靶效应（Off-target effect）指的是在基因编辑过程中，CRISPR-Cas9工具除了对目标序列进行编辑外，可能错误作用于其他与目标序列相似的非目标位点，导致意外的基因组改变。为了确保基因编辑的安全性和有效性，已开发出多种方法用于检测和评估脱靶效应。

体内检测方法

体内检测方法是在活细胞或生物体内进行的脱靶效应评估，这些方法通常能更真实反映生物学环境。

GUIDE-seq

GUIDE-Seq（Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing）是一种强大的工具，用于检测CRISPR-Cas9基因编辑系统的脱靶效应。其基本原理是通过向细胞中引入双链寡核苷酸标记物（dsODN），该标记物可以插入Cas9产生的DNA双链断裂（DSBs）位点。借助高通量测序技术，识别这些标记位点，从而完整发现潜在的脱靶编辑位置。GUIDE-Seq因其高效性和准确性而迅速成为评估基因编辑特异性的标准方法之一。

优缺点

优点：

• 提供全基因组水平的脱靶位点信息。
• 直接检测体内真实的双链断裂事件，而非预测或体外模拟结果。
• 能够检测低频的脱靶事件。

缺点：

• 实验操作相对复杂，要求较高技术水平。
• 可能会错过不易插入标记物的脱靶位点，对于某些难以转染的细胞类型实施难度较大。

应用场景

• 基因治疗安全性评估：确保CRISPR编辑的精准性，避免临床治疗中的脱靶风险。
• CRISPR工具优化：筛选高特异性的sgRNA或改进Cas9变体。
• 基础研究：研究DNA修复机制或CRISPR活性调控因素，作为常规脱靶检测工具。

体外检测方法

体外检测方法是在实验室条件下使用从生物体提取的成分或合成的材料进行的测试，可提供特定因素的精确控制。

Digenome-seq

Digenome-seq是一种高通量测序方法，用于全面检测CRISPR-Cas9基因编辑系统的脱靶效应。其原理基于在体外使用纯化的基因组DNA模拟Cas9的切割作用，通过将Cas9和sgRNA引入基因组DNA样本进行消化，随后对消化后的DNA进行全基因组测序，利用生物信息学工具识别双链断裂位点，从而确定潜在的脱靶编辑位置。

优缺点

优点：

• 能够在全基因组水平上无偏见地鉴定脱靶位点。
• 提供比计算预测更高的准确性。
• 不需复杂的体内实验设置，操作相对简便。

缺点：

• 可能遗漏仅在细胞内环境中发生的脱靶事件。
• 需要大量起始DNA和高级测序设备，且成本高。
• 数据分析流程复杂，需要专业的生物信息学支持。

应用场景

• 验证新设计的sgRNA的特异性。
• 比较不同Cas9变体或修饰版本的效果。
• 在临床前研究中评估基于CRISPR的治疗策略的安全性和有效性。

其他检测方法

除了上述方法，还有许多新兴的脱靶检测技术，如SITE-Seq、CIRCLE-seq和CHANGE-seq等。这些技术各有优缺点，研究人员可根据具体实验需求选择合适的方法。

在生物医疗领域，尤其是在CRISPR技术应用中，脱靶现象尤为关注。本文详细介绍了多种主流的CRISPR脱靶检测方法，但没有一种方法可以适用于所有情况。在实际操作中，尤其是临床试验中，全面评估CRISPR的脱靶风险需要结合多种检测方法。每条sgRNA不可避免地存在脱靶位点，如何评估和降低这种风险是未来研究的重要方向。

我们期待更多高效准确的脱靶检测手段出现，进一步提升基因编辑技术的安全性和可靠性。作为市场领先的科技企业，ag尊龙凯时在基因编辑安全性评估方面提供全方位服务，持续助力生物医疗行业的发展。

此外，ag尊龙凯时近两年来开发了一种切割效率高、脱靶效应低的新型CRISPR技术，显示出其在基础科学研究和基因治疗中的巨大应用潜力。这一成果已获得多国专利，并发表在国际著名期刊上，为生物医疗领域带来新的突破。